Derseya paqijiya proteîn pêwist e ku di çarçoveyîna bikaranîna proteîn de ye.
Ji bo hin serîlêdanan, pişkek bermîl e. Lêbelê, ji bo bikaranîna din, wekî di xwarin û dermanan de, asta paqijiya bilind heye. Ji bo vê gihîştina vê gelek proteînan de rêbazên paqijkirinê bi gelemperî têne bikaranîn, di rêzeyek pîvanên paqij kirin.
Her pêngavek paqijkirina proteîn bi gelemperî hin asta hilberê hilberîn. Ji ber vê yekê, stratejiya paqijkirinê ya îdealek yek e ku di asta herî kêm de paqijkirina herî paqij e. Hilbijartina kîjan pêngavên karanîna bi karanîna bi mezinahiyê, hejmar, nerazîbûn û taybetmendiyên din ên proteinê armancê girêdayî ye. Wek teknolojiyên jêrîn ji bo proteînek cîtosolic tenê paqij e. Paqijkirina komên proteînok ên cytosolîk zehmet e û gelemperî hewce dike ku rêbazên cûda bêne bikaranîn.
Ji bo Paqijkirina Protein First Steps
Yekem yekem di nav intracellular de paqijkirin (di hundirê hucreyên hucreyê) amadebûna amadekirinê ya xavê ye .
Derxistin tevlîhevkirina tevahiya protein ji cytoplasmên hucreyê, û hinek macromolecules, cofactors û nutriyên din jî hene. Lêgerîna kûçeyê ji bo hin bernameyên bi biotechnology tê bikaranîn, lêbelê, heke heke pirsgirêkek paqij e, paşê gavên paşvekirinê divê paşve bibin.
Derveyî hilberên crude protein bi rakirina hilberîna hucreyî ya hucreyê bi rêya lîsans ve tê amade amade kirin, ku bi karanîna kîmyewî û enzymes , sonication an çapemeniya fransî tê kirin. Bendavê ji hêla centrifugasyonê ve tê veşartin, û supernatantê hat avêtin. Preparations of crude of proteins of extracellular may be by simply simply cells by centrifugation derxistin.
Ji bo serîlêdanên biotechnolojî hene, daxwazek ji bo enzymesên thermostable heye : Enzymes ku dikare bêyî şermezarkirina bilind bilind bike, û dema ku çalakiya taybet a taybet biparêzin. Organîzyonên ku hilberînin ew carinan carinan têne gotin. Vê nêzîkek hêsantir bi paqijkirina hilberîna germbûna berxwedanê ye, ew e ku pêvajoyên din ên bi germkirina germkirina germkirinê, paşê çareserkirina pêdivî ye (bi vî awayî ku enzyme thermostable re guhertin an jî redissolve dibe.
Stepên Paqijbûnê yên Navneteweyî
Di dawiyê de, gavê duyem a ku ji bo hilberîna proteîn ji paqijkirina paqijbûnê ve di çareseriyê de bi hêza osmotic bilind (wek çareseriyên xwê). Aculên nukleîk ên di derheqê kûçeyan de ji hêla kompîteyên erzimanî bi sulfate û sulfate prototonê ve têne avakirin.
Protein barê bi gelemperî bi bikaranîna ammonium sulfate tê bikaranîn.
Cûreyên cûda yên cuda di nav hewceyên cuda yên ammonium sulfate de cih digirin . Di gelemperî de, proteinên giraniya molekular ên bilind di nav kişandinên sembolê de ammonium kêm. Vala nehêl ne bi gelemperî bi proteînek paqijkirî pir mezin dibe lê dibe ku dikare bi proteinên hêrsîn ên ku di tevlîhevkirinê de tevlihev bikin û tevlihevkirina xwe bikin. Salans di çareseriyê de bi rêya dîskîsyona bi tîrêjên hucreyan ên tilîlî, fîlîzasyon, an jî çromatografiya gel veqetandin.
Pêşniyarên bernameya berbirovan bi piraniya karûbarên gelek bazirganî-peyda hene ku ji bo çareserkirina rêbazên standard-rêyên çareseriyê pêşkêş dikin. Paqijkirina Protein pir caran bi karanîna pelan û stûnên gelên jibergirtinê amade kirin. Her tiştê ku hûn bikin, bi rêberî dike û rêbaza rastê çareseriya rastê bistînin û demek dirêjkirî bisekinin, dema ku lihevhatinê de (bisekine din endama paşê çi ye) di tiliya testê de nû.
- Rêbazên Chromatograf dikarin bi karanîna bench-top û anîna HPLC otomatîk bêne bicihkirin. Piştrastkirina HPLC dikare ji hêla reverse-phase, ion-exchange an jî mezinahiya mezin-rêbazên veqetandî, û nimûneyên bi hêla teknolojî an bi laser ve têne dîtin.
Protein Visualization and Assessment of Purification
- Guromatografyona veguhestinê (RPC) ji hêla hîdrobobîjiyan re girêdayî protein veguherîne. Ev teknîkî pir bijarte ye lê lêgerîna bikaranîna hilberên organîk. Hin protein ji hêla solvents ve têne betal kirin û dê di dema RPC de karbidestiyê winda bibin. Ji ber vê yekê ev rêbaz ji bo hemî daxwaznameyên pêşniyar nayê pêşniyar kirin, bi taybetî jî heger ji bo proteînek armanca ku hewce ye ku çalakiya xwe bigirin.
- Chromromografiya danûstendina Ion bi veguhestina proteînan ve girêdayî ye. Column dikarin ji bo danûstandina anonê an guhertina cationê amadekirin. Kolên danûstandinên Anion di çarçoveyeke stenbolê de bi bihayê erênî yên ku bi pêvajoyên negatîf bi negatîf têne bisekinin. Dîmên danûstandinên cation yên reverse, mîkrobeyên negatîf ên ku bi proteinsên xwe bi erênî ve girêdayî bûne veguhestin in. Elutioniya protein (armanc) ya armancê bi guhertina pelê ve tête çêkirin, ku di guherîn an neutralîzasyonê de grûbên karker ên her protein.
- Ji hêla chromatografiyê (Jihevkirina gelan ) Ji hêla mezin a molekulikan ve bi polîtîkaya cross-linked-a di columna chromatograf de zûtirîn rêveçûna piçûkên mezin ên piçûk dûr dike. Parîteyên mezin ên li porrên polymer nebin, lê ku proteinên piçûk hene, û ji hêla rêwîteya rasterast ya rasterast bi dora kromatografography ve digerin. Eluate di çarçoveyek zûda de li ser rêzên tubên cûda yên dabeş kirin. Gelê pîlanîna gazê ji bo ji bo prototînek pêvajoya berbiçav ve ji hêla protein ve têkoşîna armanca veberhênanê ya piçûkek piçûktir ji hêla destpêkê ve hate zêdekirin. Bi heman awayî teknîkên filtration dikare di dema ku hilberîna wan ya hilberîna wan bi hilberîna proteîn a mezin-piçûk tê bikaranîn.
- Çromatografiya girêdan ji bo "polishing" yan jî pêvajoya paqijkirina proteînek pir baş e. Beads di kolonografîk de li ser ligands-ê ku bi taybetî bi protein-target ve girêdayî ne girêdayî ne. Piştre proteîn ji kolona ji hêla çareseriyê ve girêdayî ye ku bi ligandsên azad hene. Ev rêbaz dide encamên herî paqij û çalakiyên herî taybet dide ku ji hêla teknolojiyên din ve.
- SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis gelo, di dema hebûna SDS (sodium dodecyl sulfate) de pêk hatibû ku ji bo proteînan ew ji sûcek neyînî ya neteweyeke mezin tê kirin. Ji ber ku bihayên hemû protein wekhev in, ew rêbaz ew bi temamî li gor mezinahiya wan veqetîne. SDS-PAGE gelek caran bi karanîna paqijkirina proteînan piştî ceribandinê. Wekî proteînên nêvekirî ne dihêle, ji hêla tevlîhevkirinê ve têne derxistin, hejmareke bandorên li ser SDS-PAGE gel gel kêm dibe, heta ku tenê tenê yek bandek proteînek hewceyê nîşan bide.
- Immunoblotting teknolojiyek dîtina proteîn e ku di çarçoveya chromatografiya girêdan de tê bikaranîn. Antibodies ji bo proteinek taybetmendî wek ligands li ser pêwendiya kromatografiya girêdayî tê bikaranîn. Parastina armanc hedef li ser kolanê, paşê bi hêsankirina dora çareseriyê an solahiyên din ên jêbirinê ve hatî rakirin. Antibodies girêdayî ku di bin destnîşanîna armancên armancê de alîkariya alîkarî ya radyaktîk an dye ve girêdayî ye ku careke din ji tevlihevkirinê vekir.
Çavkaniyên
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Hêveka Paqijkirina Protein, Pirtûkxaneya AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.